做座制备色谱技术与操作及实验经验

制备色谱技术与操作及实验经验

1 制备色谱到底是什么？

（1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。

为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。

然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。

（2）样品的前处理：

制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。

（3）制备色谱柱的材质及其特点

下面介绍一下，制备色谱柱常用的材质及其特点。

各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。

不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很1、实验目的小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。

有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。

（4）固定相的选择

硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理。

（5）装柱方法的选择：根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于20－30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击－装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为30－40bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种：径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。

（6）流动相的选择

除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。

如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。

（7）加样的方法

可以采用以下方法之一进样。－用注射器进样－用旋转阀进样－通过六通阀进样－通过主泵进样－通过辅泵进样－固体上样

（8） 泵的选用

生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。

（9）检测器的选用

一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。

（10）组分保留时间的估计

用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。

分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。

（11）产品的收集

手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。

（12）超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用

在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系，不在这里叙述。

（13）柱转换技术

通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个（或几个）组分的精制。

（14）比较新的制备色谱技术

模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。

迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用。

实验经验：

1 问: 我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。

答：可以配一个PDA，另外加一个示差折光410，另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速最大为20mL/min，一般可以配20mm ID的制备柱，一次分离mg的样品，如果样品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性，最好配上Fraction II 馏分收集器。

如果样品数量是科研院校、大专院校、工矿企业、技术监督、商检仲裁等部门的理想测试装备很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运在ELV领域行。最大通量每天可以处理个样品。

2 问： 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent 1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的目前杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析；使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug，显然浓度太低，最好是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

3 问： 我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用什么样的柱子

答： RP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐放大纯化的方法。

4 问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？

答：（1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0..1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。

（2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。

（3）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。

5 问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？

答（1） 了解一下样品的性质,根据其酸碱性,极性等性质，通过调节溶剂的pH值等, 以达到较好的溶解度

（2）样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶。

（3）不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO，对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。

（4） 可以固体上样